核黄素的吸收发生在小肠近端，并经门静脉运输到肝脏。在肝脏核黄素再转变成作为辅酶的FMN和FAD。
核黄素在机体吸收量与其摄入量成正比。一般来说，动物来源的核黄素比植物来源的核黄素容易吸收。胃酸和胆汁有助于游离核黄素的释放，有利于核黄素的吸收;抗酸剂可干扰食物中核黄素的释放;二价的金属离子，如Cu2+、Zn2+、Fe2+等通过螯合，能抑制核黄素的吸收;酒精亦可干扰核黄素的消化和吸收。
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