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第二十六章 抗真菌药与抗病毒药
一、抗病毒治疗的研究概况
病毒感染性疾病严重威胁人类健康和生命,已成为困扰医学界的一大难题,特别是某些病毒感染性疾病的增长速度相当快,严重影响着全人类的健康。翻开人类瘟疫的历史我们更能看到一些令人触目惊心的数字,公元1555 年,墨西哥天花大流行,200 万人不治而亡;1918 年世界范围内发生流感造成2000 万人死亡,大约是打了四年的第一次世界大战死亡人口的一倍。尽管药物和疫苗的发明及应用让人类走出了传染病的历史阴影,然而,我们发现人类的喜悦是那么短暂,今天我们仍然被形形色色的传染病所困扰,尤其是那些层出不穷的新病毒更成为人类心头一块挥之不去的阴霾。仅二十世纪后半页,1969 年西部非洲出现拉沙病毒,1976 年非洲大陆出现了埃博拉病毒,1981 年被称为世纪灾难的AIDS 出现,还有汉坦病毒、尼巴病毒、马尔堡病毒等等,特别是自1981 年以来艾滋病全球感染者人数已达134000 万,已成为一种严重的灾难性和全球性流行的疾病,世界上没有一个国家和人群能够幸免,自艾滋病在全球流行以来,已有1170 万人死于这种疾病 。非典的到来,更使人们措手不及。因此,研究和开发新的抗病毒药物和新的治疗方案是摆在我们面前艰巨的任务。
1. 抗病毒药物的应用
抗病毒药物是病毒性感染疾病治疗的主要药物,特别是自艾滋病流行以来,抗病毒药物的研究与开发进入了鼎盛时期,新的药物不断面市。归纳起来主要有以下几种:
(1)核苷类药物，系化学合成的抗病毒药物,其主要品种有无环鸟苷(阿昔洛韦,acyclovir)，羟甲基无环鸟苷(更昔洛韦,ganciclovir) 等。
(2)非核苷类药物，主要有膦甲酸钠(foscarnet sodium)，三氮唑核苷(利巴韦林,vibarvirin) 和金刚烷胺(amantadine)。
(3)几种新上市的药物，扎那米韦(zanamivir,商品名:Relwnza) 和磷酸奥司它韦(oseltamivir phosphate,商品名达菲)，是一种神经氨酸酶抑制剂，可选择性的抑制流感病毒表面的神经氨酸酶，抑制流感病毒的复制。
(4)抗病毒药物存在的缺陷迄今临床应用的抗病毒药物种类极少，且其作用机制相似，它们大都是对活跃复制的病毒有效，而不能清除潜伏状态或非复制期病毒。长期使用不仅可产生药物的毒性作用，而且易诱导产生耐药的病毒株。且停药后易复发，这大大限制了它的使用。已有报道表明，在有的HIV 感染病人经过长达100周以上的高效抗逆转录(HAART) 治疗后，仍可发生病毒毒力的回复。
2.干扰素(interferon，IFN)
干扰素是一类能提高机体免疫力，具有抗病毒抗肿瘤作用的细胞因子，干扰素有两个主要亚型，即Ⅰ型和Ⅱ型，它们可被不同的受体识别， IFN-tau 是Ⅰ型干扰素的新成员，它有其它Ⅰ型干扰素所具有的治疗作用，但它在高浓度时对细胞的毒性作用比其它Ⅰ型干扰素小，并且它没有种属特异性，它可在口服给药后仍有活性。
(1)干扰素的抗病毒作用机制：各种细胞表面都存在IFN 受体， IFN 与同种细胞受体结合后，经细胞内途径激活干扰素刺激基因( ISG) ，诱导合成几种抗病毒蛋白，最终使病毒RNA降解或最终抑制病毒蛋白翻译，从而使细胞在数分钟内形成抗病毒状态。
(2)常用的几种干扰素:①单一亚型干扰素IFN-α-2a、IFN-α-2b、IFO-α-2c等。最近，Lau GK 等通过将814 名HBeAg 阳性的慢性乙型肝炎患者分成三组，分别给予IFN-α-2a、IFN-α-2a 联合拉米夫定(lamivudine)、拉米夫定(lamivudine)。经过72 周的治疗观察后发现，单独给予IFN-α-2a 或IFN-α-2a 和拉米夫定(lamivudine)联合应用的患者HBeAg和HBsAg 的血清转阴率和对乙型肝炎病毒(HBV)DNA的抑制效率明显比单独给予拉米夫定(lamivudine) 的患者高。这表明对于HBeAg 阳性的慢性乙型肝炎患者，IFN-α-2a 的疗效明显优于拉米夫定(lamivudine)。②复合干扰素(consensus interferon，CIFN)，是一种以基因工程技术合成的新型干扰素，目前用于丙型肝炎的抗病毒治疗。③长效干扰素(peg-IFN) ，是第二代干扰素，系IFN-α与惰性分子聚乙烯二酸( PEG) 的结合物分子量增大至1.2 Kda，使其半衰期较长，可在体内较长期维持有效的血药浓度，每周只注射一次，现有peg-IFNα-2a和peg-IFNα-2b 两种试剂，目前也主要用于治疗慢性丙型肝炎。
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3. 基因治疗在抗病毒治疗中的应用
基因治疗(gene therapy)是指通过基因转移或基因修饰的方法，将具有表达功能的基因导入到相关细胞和组织中，使转录和翻译的产物发挥治疗作用的一种治疗方法。
(1)干扰素在基因治疗中的应用：干扰素的抗病毒机制在上面已详述，它作为一种有治疗作用的蛋白分子。由于它在血液中的半衰期比较短且在血液中的浓度不稳定，这些都限制了它的应用。但如果将干扰素应用于基因治疗，即用合适的载体把干扰素的基因导入体内特异的组织，这样就可克服以上缺点，可在病毒感染部位产生恒定的浓度，而且可大大减少其副作用 。
(2)反义策略：反义策略即利用寡核苷酸与互补的RNA 序列结合以抑制蛋白质的合成或病毒RNA 复制的方法。常用的反义核苷酸是一短的RNA 或DNA 片断，通常是2～12个核苷酸。反义核苷酸在导入机体前一般要经过一定的化学修饰，这样可使其抑制核酸酶对它的水解作用，从而增强其稳定性。核酶是指一类具有双重特性的RNA分子，一是能识别特异的靶RNA序列并与之结合具有反义核酸的特性;二是具有酶活性，能通过特异性位点切割降解靶RNA序列。核酶比反义RNA 阻断活性至少高100倍，它作为抗病毒基因的新型分子，已受到广泛的重视，成为抗病毒基因治疗研究中重要的组成部分。具有催化活性的RNA分子其主要成员是锤头状核酶和发夹状核酶。根据反义寡核苷酸和核酶的作用机制，我们可以人工合成特异序列的RNA分子，使其选择性的抑制病毒的mRNA，进而抑制病毒的复制，从而起到抗病毒的作用。几种锤头状核酶已成功应用于对HBV RNA 的灭活，其目标序列有poly (A) 和HBV 尾部的核心区域等。抗HPV 的核酶对HPV 的抑制作用也有成功的报道 。
(3)RNA干扰：双链RNA(dsRNA)诱导与之同源的mRNA降解，从而导致基因沉默的现象或机制被称作RNA干扰(RNA interferene ， RNAi)。RNAi现象最初是在对植物和线虫的研究中发现的，它作为一种生物体内自然现象广泛存在于一些真菌、植物和动物中。RNA干扰是一种在进化上保守的抗病毒机制，可引起生物细胞内特异序列基因的缄默现象，RNA干扰是生物进化的结果，是生物体对病毒基因等外源性入侵核酸的一种保护性机制。许多病毒的基因组都是RNA ，即使是DNA 病毒在它的生活周期中也会产生双链RNA ，这就使RNA 干扰在细胞内发挥抗病毒作用成为可能。RNAi介导的病毒抑制效应可以在不改变病毒感染细胞基因表达的前提下来实现。RNAi现已通过抑制可以引起AIDS的细胞因子和病毒因子来抑制HIV 的复制，有研究表明已成功地通过siRNA来抑制HIV-1的tat 蛋白达到了抑制其复制的效果。Novina等设计了针对CD4分子的siRNA，导入细胞后可使细胞表面的CD4分子表达明显减少，可以防止病毒的入侵，从而保护细胞免受HIV的感染。Kapadia等通过针对HCV的siRNA也达到了对HCV 较好的抑制效应。Victor等认为尽管RNAi可对许多病毒产生抑制，但其在抗病毒方面的应用，在今后应该是通过siRNA来证实宿主细胞中哪些成分对病毒的复制是必需的，从而采取相应的措施来达到抗病毒的作用。与别的干扰基因表达的策略相比，RNA干扰有明显的优势表现在1) 高度的特异性，在RNA干扰中仅仅一个碱基的改变就会大大降低RNA干扰的效率。2)高效性，RNA干扰可使目的基因的表达降低90 %以上。3)长效性，RNA干扰产生的效应可被传递给子代。
(4)在基因治疗中遇到的难题和病毒基因治疗的前景：虽然基因治疗的研究已取得了不少进展，但从总体上说仍不够理想，基因治疗遇到的主要困难是在转移基因到足够数量的靶细胞并使基因表达方面，这个问题困扰基因治疗的整个领域。载体作为外来抗原可激活机体的免疫应答，从而可使载体失活，而且载体导入人体后有可能对患者造成严重的后果。因此在将载体导入人体之前，其安全性问题是值得考虑的。虽然病毒的基因治疗还不是很成熟，但病毒的基因治疗方法是很有前景的治疗方法，病毒的基因治疗在不久的将来一定会表现出它最大的潜能。
4. 疫苗的应用
从近百年来的历史情况来看，一个非常明显的事实就是病毒疫苗在人类控制病毒性疾病过程中的功劳远远大于抗病毒药物的使用，多种抗病毒疫苗的研制成功，在相当的时间内，创造了在历史上消灭天花和控制脊髓灰质炎、麻疹等烈性及重症传染病的奇迹。但疫苗也有一些不尽人意的地方。首先，一些重要的病毒性疾病的病原研究尚不够充分，它们在宿主细胞内尤其在人体内的增殖及由此引起的病理学机理也不十分清楚，因而对其疫苗的设计、选择本身就无法在一种具有可预测性的理论基础上进行。其次，许多病毒，例如HIV、冠状病毒、流感病毒等，均有较强的抗原变异特性，以致于无法掌握什么样的抗原才能诱导相对有效的免疫应答;再者，疫苗是一种“后知后觉”的产物，所以，它的应用也受到了一定的限制。
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5. 微生态制剂在抗病毒感染中的运用
目前使用的微生态制剂主要有整肠生(含需氧地衣芽孢杆菌) 和丽珠肠乐(含双歧杆菌和乳酸杆菌)。它们已广泛运用于慢性肝炎的治疗中。
6. 中医药在病毒感染性疾病治疗中的应用
病毒感染属于中医学中“疫毒”、“瘟疫”范畴，中医防治病毒感染性疾病主要通过阻断病毒的繁殖过程中的某一环节而直接抑制病毒促进机体的特异性和非特异性免疫而提高机体的免疫功能，在病毒感染性疾病治疗中的应用比较广泛。临床观察和实验室研究也表明中医药确有优势，研究和开发新的抗病毒感染性疾病的中药有着广泛的前景。目前，国内抗病毒中药的研究主要集中在对乙型肝炎病毒、艾滋病毒、疱疹病毒、柯萨奇病毒、呼吸道病毒、流行性出血热病毒等的治疗和预防方面，目前已从中筛选出一批抗病毒中药 。
如能全面了解病毒与宿主细胞及机体之间的关系，确立更多关键环节作为抗病毒靶位点来进行药物开发。在基因治疗方面，现在大多是通过抑制病毒的某些基因来达到抗病毒的作用。在宿主体内一定存在着某种基因是病毒复制所必须的，我们可以通过抑制这些基因的复制来达到抑制病毒复制的目的，并且这些基因的抑制不会对人体产生大的影响。在载体设计方面，如何能设计一种既不引起机体的免疫应答，又安全高效的载体是我们面临的一大挑战。
二、抗真菌药物的作用机制与真菌耐药性
抗真菌药物的研究和应用，从上个世纪的发展情况来看，大致可以分为以下几个阶段：第一个发现并被用于临床的，为上个世纪30年代末从微生物发酵代谢产物中分离得到的灰黄霉素;1944年报道了唑类化合物的抗真菌作用;1949年从微生物代谢产物中分离得到了制霉菌素;1956 年报道了两性霉素B的抗真菌活性;1958年灰黄霉素被用于临床;同年，上市了第一个唑类抗真菌药物;1960年两性霉素B被用于临床;1962年报道了氟胞嘧啶的抗真菌活性;1969年咪康唑和克霉唑(局部)被用于临床;1974年伊康唑被用于临床;1978年描述了阿莫罗芬;1979年咪康唑制剂在英国上市;1981年酮康唑口服制剂在美国通过;同年第一个烯丙胺类药物萘替芬进入临床试验;1987年开始研究开发多烯类药物的脂质体制剂;1988年开始试验第一个刺白菌素类药物;1990～1992年氟康唑和依曲康唑开始在美国使用;1993～1995年报道了第二代三唑类抗真菌药物;1995～1996年通过了第二个烯丙胺类药物特比萘芬，以及通过了两性霉素B脂质体制剂;1997年通过了伊曲康唑口服溶液制剂;2001年上市了第一个刺白菌素类药物caspofungin。相对于抗细菌药物的开发，新品抗真菌药物的开发速度似乎比较缓慢。
近20多年来，随着大量广谱抗生素的应用、骨髓和脏器的移植、皮质激素及免疫抑制剂的应用、艾滋病发病率的增加、各种导管的介入和真菌检测技术的提高，念珠菌血症和系统性曲霉感染逐渐增多。北京协和医院报道在四个不同年代败血症血培养的结果显示，1994～1995年真菌发生率为8.11%;2000年为6.7%。20年149例真菌感染的分析显示，真菌感染呈逐年上升的趋势。临床上已有耐氟康唑的念珠菌和耐两性霉素B的曲霉存在。因此需要新的抗真菌药物。目前即将推出和已上市的新药有：多烯类的制霉菌素脂质体、两性霉素B脂质体剂型AmBisome、两性霉素B脂质体复合物Abelect、两性霉素B胶样分散体Amphotec、伊曲康唑口服液和注射剂、伏立康唑注射剂和口服片剂以及卡泊芬净注射剂。各种新药均有其特点与不良反应，但总的是新药的开发和临床应用，将会对侵性真菌感染提供有力的治疗措施，真菌感染的治疗前景将会有进一步的改观。
1.抗真菌药物的作用机制
目前应用于临床的抗真菌药物，就其作用机制分类，大致可以分为三种：一是作用于真菌细胞膜中甾醇合成的抗真菌药物，包括酮康唑等唑类药物、多烯类抗生素两性霉素等，以及烯丙胺类药物特比萘芬等;二是作用于真菌细胞壁合成的抗真菌药物，如刺白菌素类药物caspofungin (其抑制真菌细胞壁主要成分1，3-β-D-葡聚糖的合成)，以及抑制几丁质合成的日光霉素和多氧霉素等;三是作用于核酸合成的抗真菌药物，如5-氟胞嘧啶等。
(1)作用于真菌细胞膜中甾醇合成的抗真菌药物及其耐药性：麦角甾醇作为构成真菌细胞膜的重要成分，对于维持细胞膜的流动性、生物调节以及立体结构等起着重要的作用，而构成细胞膜的甾醇应该是C-4位去甲基的。唑类药物的主要作用机制是抑制14α-去甲基酶的活性，而在对这类药物产生耐药性的菌株中，该酶或是过量表达，或是低水平表达甚至不表达;同时，也有可能降低了药物与该酶的亲和力，以及存在有药物主动外排的机制。
像两性霉素B这样具有较大分子的多烯类药物，其对真菌细胞膜的磷脂双分子层上的甾醇物质发生交互作用，导致细胞膜上产生水溶性的孔道，即具有打孔作用，使细胞膜的通透性发生改变，最终导致重要的细胞内含物流失而造成菌体死亡。尽管像两性霉素B和制霉菌素这样的多烯类抗真菌药物已经在临床上使用了30多年，但耐药菌的出现频率还是非常低的。最近的研究表明，真菌对这类药物产生耐药性的主要机制是：其细胞膜中的麦角甾醇结构发生了改变，而没有麦角甾醇的合成，致使细胞膜的流动性发生了变化，以及降低了对细胞膜的亲和力。
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烯丙胺类药物的作用机制是作用于麦角甾醇生物合成较早的步骤，其作用靶位为鲨烯环氧化酶，该酶催化鲨烯的环氧化反应。真菌细胞的死亡主要是由于细胞膜中鲨烯的累积，而不是麦角甾醇的不足。因为高浓度的鲨烯有可能增加细胞膜的渗透性，从而导致正常细胞膜结构的破坏。真菌对这类药物产生耐药性的研究报道目前还比较少。
(2)作用于真菌细胞壁合成的抗真菌药物及其耐药性：真菌细胞壁中含有特殊的甘露聚糖、几丁质、α-和β-葡聚糖成分，这就为寻找具有毒性差异的抗真菌药物提供了基本思路和方法。由美国默克公司研究开发的半合成刺白菌素B衍生物caspofungin( MK-0991)，为第一个作为β-葡聚糖合成酶抑制剂而用于抗曲霉感染的药物。这类化合物作为该酶的非竞争性抑制剂，在抑制其生物活性的同时，不影响核酸和甘露聚糖的生物合成。但这类药物有另外一种次级效应，如降低麦角甾醇和羊毛甾醇组分的合成以及增加几丁质的合成。由于具有这类结构的化合物对于很多对唑类药物产生耐药性的真菌具有良好的抗菌活性，且仅对低等真核生物细胞壁β-葡聚糖合成酶产生抑制作用，对高等生物影响不大，而具有低毒高效的临床效果。因此，这类药物成为抗真菌药物开发的热点。目前有不少具有临床应用价值的刺白菌素类药物正在进行临床研究或临床前的研究工作。由于作为1，3-β-D-葡聚糖合成酶抑制剂的抗真菌药物刚刚在临床上使用，所以目前很难从临床分离得到这类药物的耐药菌。因此，对这类耐药菌的耐药机制的研究，都是以从实验室处理得到的突变株作为材料进行分析的。
正在研究中的其他一些作用于1，3-β-D-葡聚糖合成酶的抗真菌药物有：刺孢曲菌素类、牟伦多菌素类、WF11899和萜类化合物等，它们大多来自于微生物的代谢产物。许多能作为抗病原真菌的抗生素或杀虫的抗生素，多半具有抑制几丁质生物合成的作用。多氧霉素和日光霉素都能抑制真菌细胞壁的合成，其中多氧霉素D是真菌细胞壁几丁质合成酶最有效的抑制剂，它的化学结构与合成几丁质的二磷酸尿嘧啶核苷-N-乙酰葡萄糖胺相类似，是一个极强的竞争性抑制剂。日光霉素的结构类似于多氧霉素，它通过二肽渗透酶进入靶细胞，能抑制真菌几丁质的合成，是一个很有前途的杀虫、杀菌农用抗生素。近期研究表明，其有可能作为抗真菌药用于临床。对这类药物的耐药性机制研究报道较少。
正在研究中的作用于真菌细胞表面结构的其他抗真菌药物有：①Iturins 类：包括bacillomycinF、L和iturinA等。其作用机制为影响细胞膜表面张力，形成膜表面小孔，从而导致胞内钾离子和其他有用离子的泄露。②Syringomycins类：包括syringomycinE(SE)、syringostantinA和 syringotoxinB等。其作用机制为增加钾、氢和钙等离子的转膜流出，以及增加植物和酵母质膜的膜电位。SE可形成电位敏感的离子通道，改变蛋白磷酸化和H+-ATP酶的活性。
很多细菌和真菌能够产生许多具有抗真菌活性的肽类化合物，其主要作用机制是干扰真菌细胞的表面结构。另外，最近几年的研究发现，在一些哺乳类和昆虫的细胞中存在有被称为“抗菌肽”的一类物质，其具有很强的抗细菌和抗真菌活性，有些已经能够通过基因工程技术在微生物系统中制备。这些抗菌肽对真菌的主要作用机制是溶解细胞壁，从而达到抗菌作用。由于这类物质的作用机制比较特殊，因而也不易产生耐药性，是今后看好的一类抗真菌药物。
(3)作用于核酸合成的抗真菌药物及其耐药性：5-氟胞嘧啶(5-FC)是目前临床比较常用的作用于核酸合成的抗真菌药物。其在渗透酶的帮助下进入真菌细胞，一旦进入胞内，则通过胞嘧啶脱氨酶转化成为5-氟尿嘧啶(5-FU)。随之，通过鸟苷酸(UMP)-焦磷酸酶转化为5-氟鸟苷酸(FUMP)，其进一步被磷酸化后掺入到 RNA中，最终破坏蛋白质的合成。5-FU也能够被转化为5-氟脱氧鸟嘧啶单磷酸，其能够抑制参与DNA合成和细胞核分裂的胸苷酸合成酶。因此，5-FU的抗菌作用机制涉及到干扰嘧啶的代谢、RNA和DNA的合成以及蛋白质的合成等。临床上很少单独使用5-FC，而往往将其与其他抗真菌药物，如氟康唑和两性霉素B等合并使用。真菌对5-FC产生耐药性的主要作用机制是由于降低了药物的吸收(即失去了渗透酶的活性);或是当真菌由于缺少胞嘧啶脱氨酶或鸟苷磷酸核糖基转移酶时，使5- FC不能转化为FUMP。
灰黄霉素能够有效地抑制表皮癣菌、小孢子菌和毛发癣菌等的生长。其作用机制可能是具有鸟嘌呤相似结构的灰黄霉素以竞争性抑制作用干扰真菌细胞的DNA合成，从而抑制其生长。它作用于敏感真菌后可致菌丝肿胀成球形，细胞壁丧失完整性，胞浆膜则近乎消失，仅遗留少量皱缩的残余物和巨大的脂类贮存颗粒。它对生长期的真菌菌丝作用更强。口服灰黄霉素后沉积于皮肤角质层，并与皮肤毛囊及甲、爪的蛋白质相结合，防止癣菌的继续侵入，最后病原体随皮肤和毛发的自然或人工脱落而离开人体。临床中还未见有耐药菌出现。
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2. 真菌耐药性发展的预防和控制
对于如何预防和控制真菌耐药性发展还没有建立有效的方法，但可以参照预防和控制细菌耐药性发展的策略，即谨慎地使用各种抗真菌药物;使用合适的剂量进行治疗，避免长期使用低剂量治疗;尽可能结合多种已有的药物进行治疗;对病因学比较清楚的疾病，要选择某种合适的药物治疗;建立真菌耐药性检测系统，了解和掌握真菌耐药性的发展趋势和频率。由于对真菌疾病的用药规律以及感染真菌的快速诊断方法都还没有确立，因此，从某种程度上来讲，还没有有效的预防和控制措施。
随着各种抗真菌药物的普遍使用，与细菌耐药性发展的过程相同，将会产生非常严重的后果。尽管对真菌耐药性的作用机制的了解，还没有像细菌耐药性那样已经有了比较系统和深入的研究，但随着真菌耐药性问题的出现和不断地发展，人们已经开始重视这一领域的研究。可以肯定，一些结构新颖、能够克服真菌耐药性的药物将随着对耐药机制的了解而出现。
例题：
1.有关灰黄霉素的错误叙述项是：
A.油脂食物可促进肠道吸收 B.对生长旺盛的真菌有杀灭作用
C.对深部真菌和细菌无效 D.干扰真菌DNA合成 E.对指甲癣疗效好
2.唑类抗真菌药的作用机制是：
A.抑制细胞中麦角固醇生物合成，增加膜通透性 B.阻止核酸合成
C.抑制二氢叶酸合成酶 D.抑制二氢叶酸还原酶 E.抑制蛋白质合成
3.对帕金森病有效的抗病毒药物是：
A.阿昔洛韦 B.利巴韦林 C.金刚烷胺 D.碘苷 E.阿糖腺苷
参考答案
1.D 2.A 3.C
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