2015初级检验技师考试：特异性IgG抗体制备

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　　在标记的免疫测定或其他技术中将特异性抗体纯化出来，是极为重要的。例如在ELISA，用于包被的抗体一定要用特异性IgG，才能得到良好的效果。这是因为全血清中有大量非抗体蛋白，如白蛋白、α1和α2球蛋白等，如不除去，会干扰包被。再如反相间接血凝，致敏红细胞的抗体也需用特异性IgG的 I(ab')2才能使实验满意。特异性IgG和F(ab')2的制备方法有如下几种。

　　(一)粗提法提取球蛋白

　　大多用硫酸铵盐析法或硫酸钠盐析法。硫酸铵盐析须经过多次沉淀，第一次用40%饱和度，第二次用35%饱和度，第三次用33%饱和度，经三次提取后的γ球蛋白基本是IgG成分。硫酸钠法更简便，用20%即可将γ球蛋白沉淀出来。

　　经盐析后的γ球蛋白虽大多属于IgG，但还有5%其他区带蛋白，如γ区的杂蛋白。又因IgG组分中还含其他所谓正常的IgG，产生干扰。因此盐析法粗提的γ球蛋白只能用于一般的实验，或者是抗体效价较高的抗血清。

　　(二)离子交换层析法提取IgG

　　常用的离子交换剂有DEAE纤维素或QAE纤维素，以QAE-Sephadex最为理想，DE22、32、52也可应用。取QAE- SephadexA25或A50经酸处理并在0.05mol/LpH7.5～8.6的磷酸盐缓冲液中平衡，将水分抽干，称湿重Ig加于10ml血清中，在室温30min后，离心或过滤除去离子交换剂。上清液再如此处理一次，即获得较纯的IgG，甚至不含其他杂蛋白。用该技术纯化IgG简便，不损坏抗体，既可小量提取，也可大量制备。

　　(三)亲和层析法提取特异性IgG

　　将纯化抗原或粗制抗原(如是单价特异性则对抗原要求不高)交联Sepharose4B制成亲和层析柱，将抗血清过柱后洗去未结合的杂蛋白，再用硫氰酸钾洗脱，流出的是纯的特异性IgG抗体。因硫氰酸钾对抗体有破坏作用，应及时透析除去。纯化的IgG因含量低，失去保护作用，应及时应用或冻干保存，亦可20℃保存，但皆不理想;加入三乙醇胺或甘油可起保护作用。

　　(四)酶解法制备F(ab')2片段

　　胃蛋白酶对IgG的作用点是在连接两重链的二硫键靠C端处(232氨基酸处)，结果两个Fab由二硫键连接，保留了抗体的结合点。与IgG相比，F(ab')2的特点是去掉了Fc段，这样在细胞免疫实验中免除了受体作用;同时也使IgG失去主要的抗原特性，不被抗IgG抗体结合;在反向间接血凝中，用F(ab')2致敏羊红细胞比用IgG效果好。