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将待测DNA片段转变成一系列放射性核素标记的单链寡核苷酸，并使其一端为一固定的末端。另一端由于长度不同，成为一系列相差一个碱基的连续末端。在分别含有4种脱氧核酸的反应体系中，寡核苷酸分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基。将4种反应体系的寡核苷酸产物，在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样于相邻的加样孔进行电泳分离。由于全部可能产生的不同大小寡聚核苷酸都存在于4种反应产物中，从放射自显影后的4种末端寡聚核苷酸梯子形图谱中，就可以直接读出DNA序列。
DNA测序技术使直接检测核苷酸突变成为可能，而不仅仅是基因片段的多态性分析，使临床基因诊断更加精确。常用于探针设计、特异引物合成、基因结构分析等，在遗传病诊断、微生物种属鉴定、肿瘤诊断等领域广泛应用，人类基因组计划就是由于大规模自动化测序技术的发展而顺利完成的。但由于DNA测序方法复杂，一般临床实验室无法进行，有必要时可委托有条件的公司或研究机构进行。