外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：①带有非互补突出端的片段：用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的黏性末端，这也是最容易克隆的DNA片段。②带有相同的黏性末端：用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。③带有平末端：是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比黏性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇( PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配，则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的连接子或适配子使其匹配，也可以有控制地使用E．coli DNA聚合酶I的klenow大片段部分填平3’凹端，使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。黏性末端与平末端不能直接连接。