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化学灭菌法是指用化学药品直接作用于微生物而将其杀死的方法。对微生物具有杀灭作用的化学药品称为杀菌剂，可分为气体灭菌剂和液体灭菌剂。杀菌剂仅对微生物繁殖体有效，不能杀灭芽孢。化学杀菌剂的杀灭效果主要取决于位生物的种类与数量，物体表面的光洁度或多孔性以及杀菌剂的性质等。化学灭菌的目的在于减少微生物的数目，以控制一定的无菌状态。
化学灭菌法可分为气体灭菌法和液体灭菌法：
1. 气体灭菌法 是指采用气态杀菌剂(如臭氧、环氧乙烷、甲醛、丙二醇、甘油和过氧乙酸蒸汽等)进行灭菌的方法。该法特别适合环境消毒以及不耐加热灭菌的医用器具、设备和设施的消毒。亦可用于粉末注射剂，但不适合于对产品质量有损害的场合。
2. 液体灭菌法 是指采用杀菌剂容易如进行消毒的方法。该法常作为其他灭菌法的辅助措施，适合于皮肤、无菌器具和设备的消毒。常采用的消毒液有75%乙醇、1%聚维酮碘溶液、0.1%～0.2%苯扎溴铵(新洁尔灭)、2%左右的酚或煤酚皂溶液等。